显微镜图像分割：使用Python进行细菌分割

Question

我正在尝试对一些显微镜下的明场图像进行分割，这些图像中显示了一些E. coli细菌。
我正在处理的图片看起来像这个（虽然这个是用相位对比法获得的）：

我的问题是，在运行我的分割函数（下面的OtsuMask）后，我无法区分正在分裂的细菌（你可以在下面的样本图像上试试我的代码）。这意味着我得到的只是一个单一的标记区域，里面有几只细菌因为它们的末端相连，而不是两个不同的标记图像。
两个正在分裂的细菌之间的边界太窄，无法通过我在阈值图像上进行的形态学操作来突出显示，但我想应该有办法实现我的目标。

有没有什么想法或建议？

import scipy as sp
import numpy as np
from scipy import optimize
import mahotas as mht
from scipy import ndimage
import pylab as plt


def OtsuMask(img,dilation_size=2,erosion_size=1,remove_size=500):

    img_thres=np.asarray(img)
    s=np.shape(img)    
    p0=np.array([0,0,0])

    p0[0]=(img[0,0]-img[0,-1])/512.    
    p0[1]=(img[1,0]-img[1,-1])/512.
    p0[2]=img.mean()

    [x,y]=np.meshgrid(np.arange(s[1]),np.arange(s[0]))

    p=fitplane(img,p0)    
    img=img-myplane(p,x,y)    


    m=img.min()
    img=img-m
    img=abs(img)
    img=img.astype(uint16)

    """perform thresholding with Otsu"""
    T = mht.thresholding.otsu(img,2)
    print T
    img_thres=img
    img_thres[img<T*0.9]=0
    img_thres[img>T*0.9]=1


    img_thres=-img_thres+1  

    """morphological operations"""
    diskD=createDisk(dilation_size)
    diskE=createDisk(erosion_size)

    img_thres=ndimage.morphology.binary_dilation(img_thres,diskD)   

    labeled_im,N=mht.label(img_thres)
    label_sizes=mht.labeled.labeled_size(labeled_im)
    labeled_im=mht.labeled.remove_regions(labeled_im,np.where(label_sizes<remove_size))    


    figure();
    imshow(labeled_im)

    return labeled_im

def myplane(p,x,y):

    return p[0]*x+p[1]*y+p[2] 

def res(p,data,x,y):

    a=(data-myplane(p,x,y));

    return array(np.sum(np.abs(a**2)))

def fitplane(data,p0):

    s=shape(data);

    [x,y]=meshgrid(arange(s[1]),arange(s[0]));
    print shape(x), shape(y)

    p=optimize.fmin(res,p0,args=(data,x,y));
    print p
    return p


def createDisk( size ):
    x, y = np.meshgrid( np.arange( -size, size ), np.arange( -size, size ) )
    diskMask = ( ( x + .5 )**2 + ( y + .5 )**2 < size**2)
    return diskMask

OtsuMask代码的第一部分包括一个平面拟合和减法操作。

Answer 1

有一天，我发现 skimage的分水岭分割 对我来说比任何OpenCV的示例都要有用。它使用了一些从 Cellprofiler 项目借来的代码（这是一个基于Python的工具，用于复杂的细胞图像分析）。小提示：使用 OpenCV的欧几里得距离变换，它比scipy的实现要快。此外，peak_local_max 函数有一个 distance 参数，这对精确区分单个细胞非常有用。我觉得这个函数在寻找细胞峰值方面比简单的阈值方法更可靠（因为细胞的强度可能会有所不同）。

你可以找到scipy的分水岭实现，但它的表现有点奇怪。

Answer 2

这里有几点想法：

1. Otsu方法可能不太合适，因为你可以直接用一个固定的阈值（你的细菌是黑色的）。
2. 用任何方法对图像进行阈值处理都会丢失很多有用的信息。

我没有完整的解决方案给你，但即使是这个非常简单的操作，也能提供很多有趣的信息：

import matplotlib.pyplot as plt
import cv2

# cv2 is only used to read the image into an array, use only green channel
bact = cv.imread("/tmp/bacteria.png")[:,:,1]

# draw a contour image with fixed threshold 50
fig = plt.figure()
ax = fig.add_subplot(111)
ax.contourf(bact, levels=[0, 50], colors='k')

这样做会得到：

这表明，如果你使用固定轮廓的轮廓追踪技术，你会得到相当不错的膨胀和腐蚀的起始点。所以，在阈值处理方面有两个不同之处：

1. 轮廓处理比简单的黑白阈值处理使用了更多的灰度信息。
2. 固定阈值在这些图像上效果不错，如果需要进行光照校正，Otsu方法就不是最佳选择。

Answer 3

可以用一种和这个相关的StackOverflow回答类似的方法来解决这个问题。

大致步骤如下：

• 先对你的图像进行阈值处理，就像你之前做的那样。

• 在处理过的图像上应用距离变换。

• 对距离变换的结果再进行阈值处理，这样每个细菌只会留下一个小的“种子”部分。

• 给这些种子打上标签，每个种子用不同的灰度值表示
  （还要给背景也加一个标签种子）

• 用这些种子和距离变换后的图像执行分水岭算法，这样就能得到细菌的分离轮廓。

可以查看链接中的回答，里面有一些图片会让这个过程更清晰。